通过体外转录（IVT）技术获得的mRNA反应混合物中，除了所需的mRNA产物外，还混杂了多种杂质，包括T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、模板DNA、盐离子、各类添加剂，以及IVT过程中产生的mRNA副产物（如dsRNA和截断RNA片段）。这些杂质可能会对mRNA的功能产生负面影响，如影响mRNA的准确定量、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，有必要通过纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离出来，以确保其纯度和完整性，这对于保证产品的安全性和有效性至关重要。

常见的mRNA纯化技术主要包括氯化锂（LiCl）沉淀法、硫酸铵沉淀法、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化以及层析纯化等。在科研和早期应用中，沉淀、磁珠和硅胶柱等方法因其操作简便、快速，但纯化效率较为有限，通常应用于小规模实验。在工业生产中，层析纯化方法则是最主要的选择。

硫酸铵沉淀法

中科院过程工程研究所张松平团队于2024年1月发表了一篇题为“Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature”的文章，探讨了硫酸铵沉淀mRNA的可行性。研究中，使用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码的mRNA作为对象，发现当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。进一步提高硫酸铵浓度则对沉淀速率影响不大。溶解率是影响最终回收率的重要指标，结果显示在高于18M的硫酸铵浓度下，沉淀物可在3分钟内迅速溶解于无RNase水中，溶解率超过90%。推荐的最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS），pH 7.0，温度20℃，沉淀时间2小时，均可达到近100%的沉淀率和溶出率。

硅胶柱膜纯化法

硅胶柱膜纯化法利用硅胶膜表面的硅醇基团与mRNA分子之间的相互作用，其弱酸性的硅醇基团在水化后带负电。在高盐环境下，阳离子桥的形成中和了mRNA和硅醇基团之间的静电排斥，从而促进它们的结合。低盐或水溶液状态下，硅胶膜则会释放mRNA。这种方法对蛋白质、多糖和脂类等杂质没有吸附性，因此在高速离心过程中可以有效分离mRNA和杂质。硅胶柱膜法的材料安全无毒，符合环保理念，保证了实验人员的健康和减少环境污染。

层析法

目前，工业级纯化通常采用层析法，以达到更高的核酸质量和产量。目前的主流方法是Oligo(dT)亲和色谱，但由于其与Poly(A)尾的杂交，无法有效区分带有Poly(A)尾的ssRNA和dsRNA等杂质。为了提升纯化效果，通常结合疏水层析、阴离子层析等手段。Oligo(dT)亲和层析的工作原理是在高盐条件下通过静电屏蔽作用促进mRNA与Oligo(dT)的结合，随后通过降低盐度洗脱mRNA。

在mRNA的工业纯化流程中，目前大多数采用的步骤为TFF1-层析-TFF2。TFF1步骤目的是去除蛋白、DNA模板和NTP等杂质；层析步骤主要捕获mRNA及去除dsRNA等不纯物；TFF2步骤则用于将最终产物置换至制剂缓冲液中。在特定条件下，采用蛋白酶K与TFF结合的方法进行下游纯化，可以有效去除与核酸结合的蛋白质杂质。

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