一、实验准备

本实验将使用918博天娱乐官网提供的wako质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061，进行相关的酶活性测定及多肽抽提实验。

二、单位的定义

赖氨酰肽链内切酶的酰胺酶单位被定义为在30℃、pH 9.5条件下，每分钟能产生1μmol对硝基苯胺的酶量。单位计算公式如下：AU/vial = [(a-b)/25] × (1/962) × (40/01)，其中a为检测样品中的吸光度，b为空白对照中的吸光度。

三、实验操作流程

在进行实验操作时，请遵循以下步骤以确保结果的准确性：

1. 使用聚硅酮处理的微量离心管和吸管，避免蛋白质的捕获。
2. 采用质谱分析适用的凝胶染色试剂盒，如银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）进行操作。
3. 电泳分离蛋白质样品。
4. 切割凝胶中的蛋白质片段，并放入微量离心管中。
5. 使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液使凝胶脱色。
6. 向管中加入300μL乙腈，搅拌器振荡30分钟。
7. 去除乙腈后，用Parafilm膜覆盖微量离心管。
8. 在Parafilm膜上打孔，然后进行真空干燥15分钟。
9. 在100μL 10mmol/L DTT与100mmol/L碳酸氢铵中，56℃恒温反应1小时。
10. 室温冷却后，加入等量的50mM碘乙酰胺，在暗处恒温45分钟并涡旋。
11. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵洗涤凝胶片段10分钟。
12. 用300μL乙腈干燥凝胶片段15分钟。
13. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵溶胀凝胶片段15分钟。
14. 再用300μL乙腈干燥凝胶片段15分钟。
15. 去除液相，真空干燥凝胶片段15分钟。
16. 用100μL赖氨酸内切酶溶液在冰水浴中溶胀凝胶片段45分钟。
17. 去除100μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段置于37℃、10μL 50mmol/L Tris-HCl pH 8.5中过夜。
18. 加入50μL 20mmol/L碳酸氢铵，20分钟内振荡凝胶片段，进行3次多肽抽提。
19. 添加5%甲酸/50%乙腈，20分钟内震荡凝胶片段，进行3次多肽抽提。
20. 如有需求，使用SpeedVac浓缩多肽。
21. 通过ZipTip进行多肽的脱盐和纯化。
22. 如有需要，可以用弱真空浓缩多肽至2μL。
23. 最后，加入基质进行质谱分析。

四、购买渠道

有关918博天娱乐官网，可通过北京百奥创新科技有限公司购买wako质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061等产品，欢迎咨询！